Госпитальеры, прибыв на Мальту, дают клят­ву продолжить борьбу против мусульман и мор­ских пиратов. Теперь рыцарский орден называ­ют Мальтийским орденом. На острове рыцари воз­вели мощные береговые укрепления и крепости. Коренное население поставляло рыцарям матро­сов и солдат. Захваченные в морских сражениях и битвах на суше пленники становились рабами на галерах. Корабли рыцарей Мальтийского ор­дена захватывали турецкие суда. Рыцари ордена совершали удачные набеги на африканское побе­режье, во владения тунисских и алжирских беев. Мальтийский орден участвовал и в борьбе хрис­тиан с арабами на Пиренейском полуострове. В это время орден возглавлял Великий магистр Жанн де Ла Валетт (1557 - 1568 год правления), при нем Мальтийский орден достиг наивысшего расцвета. Все действия рыцарей ордена доставля­ли турецкому султану одни только беспокойства, поэтому он решил покончить с орденом раз и навсегда. В мае 1565 года к острову подошли 200 турецких кораблей, на которых находилась турецкая армия, состоящая из 40 тысяч отборных янычар. Этой армии проти­востояли 700 мальтийских рыцарей и 8000 простых воинов, оборону возглавлял Великий магистр Жанн де Ла Валетт, которому было уже 70 лет. Четыре месяца турки штурмовали столицу ордена, но рыцари отбивали все атаки. И только потеряв убитыми и ранеными большую часть армии, турки отступили. Потери ордена составили: 240 рыцарей и 5000 простых воинов. В честь Великого магистра, одержавшего победу над турками, столица острова была названа Ла-Валетта.

В XVI и XVII веке флот Мальтийского ордена оставался по-прежнему мощной силой. Он успешно боролся с Османской империей. Союза с Мальтийским орденом искали многие страны, в том числе и Россия. Первым русским послом на Мальте побывал при Петре I Б. П. Шереметев. Его с почетом приняли в Ла-Валетте. В дальнейшем Россия и Мальта регулярно обменивались посланиями по поводу вступления на российский престол импера­торов и императриц или избрания очередных Великих магистров ордена. Екатерина II посылала на Мальту российских офицеров для морской практики, которую они проходили на кораблях Мальтийского ордена. Однако особенно тесные отношения Мальтийского орде­на и России завязались при Павле I.

В конце XVIII века после французской революции многое изменилось в жизни Мальтий­ского ордена. Орден почти полностью утратил последние европейские владения, которые находились в основном во Франции (даже парижский замок Тампль). Надо сказать, что эти владения в Европе достались Мальтийскому ордену после расформирования ордена Тамп­лиеров. Влияние революции, произошедшей во Франции, было огромным. Революционные идеи проникли даже на остров Мальту, коренное население откровенно выказывало недо­вольство тем, что Мальтой вот уже столько веков владеет дряхлеющий рыцарский орден. Даже среди самих мальтийских рыцарей появились разделяющие революционные убежде­ния. Все это привело к тому, что в 1798 году, когда к Мальте подошел флот Наполеона, следовавший в Египет, флот ордена, считавшийся до этого непобедимым, сдался в течение одного дня. Большинство коренных жителей Мальты, служившие на острове солдатами и матросами, изъявили желание пополнить французскую армию и отправиться с Наполео­ном в египетский поход.